DNA的不同提取方法及比較

傳統(tǒng)的DNA提取方法

傳統(tǒng)的DNA 提取與純化,如 CTAB 法、SDS 法是在裂解細(xì)胞的基礎(chǔ)上,多次苯/酚氯仿等有機(jī)溶劑抽提使蛋白質(zhì)變性沉淀于有機(jī)相,而核酸保留在水相,達(dá)到分離核酸的目的;加入RNA 酶除去核酸中的RNA; 然后加入異/丙醇、乙醇等沉淀DNA;用70 %乙醇漂洗沉淀,除去分離過(guò)程中殘留的有機(jī)溶劑和鹽離子,以免影響核酸溶解和抑制后續(xù)步驟的酶促反應(yīng),最后用TE 溶解DNA 備用。 


CTAB 是一種陽(yáng)離子去污劑,能與核酸形成復(fù)合物,此復(fù)合物在高鹽( > 0. 7 mol/ L) 濃度下可溶,并穩(wěn)定存在,但在低鹽濃度(0. 1～0. 5 mol/ L NaCl) 下CTAB - 核酸復(fù)合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液中。通過(guò)有機(jī)溶劑抽提,去除蛋白、多糖、酚類(lèi)等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái)。經(jīng)離心棄上清后,CTAB - 核酸復(fù)合物再用70 %酒精浸泡可洗脫掉CTAB 。

SDS 是一種陰離子去垢劑,在高溫(55～65 ℃) 條件下能裂解細(xì)胞,使染色體離析、蛋白變性,同時(shí)SDS 與蛋白質(zhì)和多糖結(jié)合成復(fù)合物,釋放出核酸;提高鹽(KAc 或NH4Ac) 濃度并降低溫度(冰浴) ,使 SDS - 蛋白質(zhì)復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式,使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀更加*,離心后除去沉淀;上清液中的 DNA 用酚/ 氯仿抽提,反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 

SDS 法操作簡(jiǎn)單,溫和,也可提取到高分子量的DNA ,但所得到的產(chǎn)物含糖類(lèi)雜質(zhì)較多。

基因組DNA 經(jīng)典的提取方法由于無(wú)需昂貴儀器和藥品,提取的DNA 純度能夠滿足一般分子生物學(xué)的需要,一直作為DNA 提取的常規(guī)方法。但這種方法操作步驟復(fù)雜,耗時(shí)長(zhǎng),易交叉污染,殘留在DNA 溶液中有機(jī)物質(zhì)對(duì)DNA 聚合酶有抑制作用。另外,酚、氯仿等有機(jī)溶劑易造成環(huán)境污染,有損操作者健康,因此使該方法的應(yīng)用受到一定的局限性。

DNA提取新方法

近年來(lái)出現(xiàn)了以螯合樹(shù)脂、特異性 DNA 吸附膜、離子交換純化柱及磁珠或玻璃粉吸附等基礎(chǔ) DNA 提取新方法。這些方法主要應(yīng)用于提取病毒、微生物、人和動(dòng)物細(xì)胞、包埋組織樣品、古生物標(biāo)本及土壤環(huán)境樣品 DNA 。已有多篇利用純化柱和玻璃粉純化植物基因組 DNA 的報(bào)道。將CTAB 液提取和氯仿抽提兩步的上清液直接通過(guò)Wizard 純化系統(tǒng)純化得到的DNA ,RAPD 擴(kuò)增效果良好,產(chǎn)率達(dá)2 250μg/ g 。用硅珠(SiO2) 顆粒吸附DNA 純化方法,從不同樹(shù)木葉片中均得到了高質(zhì)量的 DNA 樣品 。

對(duì)常規(guī)CTAB 法提取的DNA 用玻璃粉懸浮液純化,所獲DN 的APCR 產(chǎn)物能直接測(cè)序,比較適用于富含黏多糖、單寧、多酚和萜類(lèi)化合物等次生代謝物的植物樣品和長(zhǎng)期保存的標(biāo)本材料。袁長(zhǎng)春等也用玻璃粉吸附法從富含酚類(lèi)的茶類(lèi)植物中提取純凈的總DNA。

目前國(guó)內(nèi)外開(kāi)發(fā)了多種商品化的DNA 提取純化試劑盒,其分離原理有的利用核酸的分子量差異,有的利用特異性膜與DNA 結(jié)合達(dá)到分離、回收的目的,如離子交換柱、磁珠等。這些試劑盒針對(duì)不同的材料來(lái)源設(shè)計(jì)了不同的提取方法,操作簡(jiǎn)單、高效, DNA 質(zhì)量較高,但價(jià)格昂貴,提取量少。著名的國(guó)外的試劑盒生產(chǎn)廠家有Sigma2Aldrich、Promega、Invitrogen、 TaKaRa 、Whatman 等,它們針對(duì)不同來(lái)源的材料如微生物、動(dòng)物體液、血液和組織、植物、加工產(chǎn)品、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品等開(kāi)發(fā)出一系列的試劑盒。

由于核酸提取純化試劑盒制作門(mén)檻低,還有大量的生物公司提供試劑盒產(chǎn)品,使用者一定要慎重選擇。DNA 試劑盒經(jīng)過(guò)了幾十年的發(fā)展,已經(jīng)不再局限于單純的提取純化,有些廠家推出了DNA 提取—擴(kuò)增 PCR 試劑盒,將DNA 提取和PCR 擴(kuò)增結(jié)合起來(lái),極大的提高了工作效率,如Sigma2Aldrich 公司的Sigma’s Extract2N2Amp Plant PCR kit 等。另外,還有高通量的DNA 提取產(chǎn)品,如高通量組織細(xì)胞研磨儀MM301 ,在常溫和冷凍條件下對(duì)硬性、中硬性、韌性、脆性及纖維材料的研磨破碎,每次處理樣品的個(gè)數(shù)可以多達(dá)48 個(gè)甚至192 個(gè)。美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司6100 型核酸提取儀,可用于RNA、DNA 的提取純化,可自編程序, 可選預(yù)設(shè)的程序,具有嚴(yán)格的防交叉污染體系,可從不同來(lái)源的樣品中同時(shí)提取96 個(gè)樣品。