四環(huán)素類抗生素的測定方法主要包括微生物抑制法、charmⅡ微生物受體分析法、酶聯(lián)免疫法、分光光度法、毛細(xì)管電泳色譜法、薄層色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法等。

樣品經(jīng)過提取和凈化后，四環(huán)素類抗生素可通過薄層色譜或液相色譜進(jìn)行分離，再采用分光光度、熒光或質(zhì)譜檢測系統(tǒng)進(jìn)行定量測定。

微生物法是一種傳統(tǒng)的測定四環(huán)素類化合物和其他抗生素的分析方法。微生物通常對四環(huán)素類抗生素具有固有的敏感性．對某些四環(huán)素別敏感，因而世界范罔內(nèi)仍然在使用微生物抑制法。蠟狀芽孢桿菌ATCC 11778是一種經(jīng)典的用于分析四環(huán)索類的微生物，其對金/霉素的靈敏度為0.005 mg/L，對四環(huán)素和土/霉素的靈敏度為0．025 mg/L，對二甲胺四環(huán)素的靈敏度為0.001～0.002 mg/L。相對于其他分析方法，微生物抑制法操作簡便，價格低廉，不需要精密儀器和復(fù)雜的樣品前處理過程，因而適合大量樣品的篩選。微生物抑制法的最大缺點是不能區(qū)分具體的四環(huán)素種類，因此也難以進(jìn)行定量檢測。

間接酶聯(lián)免疫法可用來檢測牛奶中的四環(huán)素類抗生素。四環(huán)素牛血清白蛋白共軛物用于抗體制備，同源的四環(huán)素-酪蛋白共軛物作為包埋試劑，而羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶作為第二抗體。牛奶樣品經(jīng)離心脫脂，采用磷酸鹽緩沖液至少以l：30的比例進(jìn)行稀釋后，直接采用酶免疫法進(jìn)行測定，檢測限可達(dá)5 ng/g由于該法所采用抗體與金/霉素有強(qiáng)烈的交叉反應(yīng)活性，因此，該法雖然不是用來檢測四環(huán)素類的，但對于金/霉素的檢測限也低達(dá)5 ng/g。劉智宏等建立了牛奶和雞肉中四環(huán)素、土/霉素、金/霉素和多兩環(huán)素的ELISA檢測方法。該方法對牛奶和雞肉中四環(huán)素的檢測限為7μg/L(μg/kg)左右。由于存在交叉反應(yīng)、假陽性率高等原因，免疫法一般作為四環(huán)素類物質(zhì)檢測的初篩方法。