什么是IF（免疫熒光）染色？

免疫熒光（IF）是一種用于檢測(cè)以及識(shí)別細(xì)胞和組織中蛋白質(zhì)和其他分子的亞細(xì)胞分布和遷移的強(qiáng)大檢測(cè)技術(shù)。IF可用作免疫組織化學(xué) (IHC) 或免疫細(xì)胞化學(xué) (ICC) 中使用的傳統(tǒng)顯色標(biāo)記的替代物。通過(guò)使用多種標(biāo)記物的二級(jí)抗體，可以研究感興趣蛋白的共定位，這是不能通過(guò)常規(guī)IHC或ICC實(shí)現(xiàn)。這是同時(shí)分析許多目標(biāo)蛋白時(shí)的一個(gè)優(yōu)勢(shì)，可同時(shí)生成大量亞細(xì)胞定位的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。

什么時(shí)候使用IF？

1.IF是一個(gè)很好的檢測(cè)技術(shù)工具，用于研究感興趣的產(chǎn)物如分子、蛋白質(zhì)或糖蛋白的表達(dá)、定位、分布和遷移。

2.用作顯色標(biāo)記物的替代物，例如3,3 '-二氨基聯(lián)苯胺 (DAB) 。

IF與ICC和IHC的區(qū)別

IHC和ICC使用的樣本類(lèi)型不同。IHC利用通常冷凍或石蠟包埋的整個(gè)組織樣本。ICC指的是分離的或培養(yǎng)的細(xì)胞樣本。這兩種樣本類(lèi)型都可以使用IF進(jìn)行標(biāo)記檢測(cè)。直接法IF使用帶有偶聯(lián)熒光染料（共軛抗體）的一級(jí)抗體。間接法IF需同時(shí)使用可結(jié)合靶標(biāo)抗原一抗和偶聯(lián)熒光染色的二抗。

優(yōu)化IF，以下IF實(shí)驗(yàn)優(yōu)化小技巧可以節(jié)省您的時(shí)間和成本，從而避免浪費(fèi)您的寶貴樣品。

1. 設(shè)置對(duì)照：可以使用陽(yáng)性和陰性對(duì)照來(lái)確定結(jié)果的準(zhǔn)確性，并幫助確定任何問(wèn)題的來(lái)源。

2. 樣品和試劑的存儲(chǔ)：由于IF中所用抗體和實(shí)驗(yàn)樣品的熒光性質(zhì)，因此必須適當(dāng)存儲(chǔ)。最好將熒光抗體和經(jīng)過(guò)IF處理的樣品都保存在wan全黑暗的環(huán)境中。使用琥珀色或鋁箔覆蓋抗體管。

3. 使用適當(dāng)?shù)墓潭▌喝┛捎糜跇?biāo)記膜結(jié)合抗原或細(xì)胞骨架抗原，并應(yīng)用于核蛋白或線粒體蛋白。醛固定后的樣本需要抗原修復(fù)和打孔滲透步驟才能正確檢測(cè)抗原。如果使用單克隆抗體推薦有機(jī)溶劑用于組織固定。甲醇適用于冷凍樣本的固定；丙酮固定對(duì)組織學(xué)保存效果較好。

4. 仔細(xì)選擇抗體：應(yīng)檢查所有抗體，無(wú)論是單克隆抗體還是多克隆抗體，以確保與目標(biāo)抗原具有高的親和力。所用的二抗必須與一抗兼容，比如使用抗小鼠二抗檢測(cè)小鼠來(lái)源的一抗。

5. 多色染色：最好使用在不同物種中產(chǎn)生的一抗。如果使用間接檢測(cè)，請(qǐng)使用已預(yù)先吸附在檢測(cè)其他蛋白質(zhì)的一抗和二抗的種屬以及實(shí)驗(yàn)樣品的物種中的二抗。這樣可以最da程度地減少跨物種的反應(yīng)性和非特異性結(jié)合。所有二抗也應(yīng)在同一物種中產(chǎn)生，以最da程度地減少交叉反應(yīng)。一旦確定抗體特異性，就可以同時(shí)或依次將目標(biāo)抗原與其抗體孵育，順序孵育往往會(huì)產(chǎn)生更好的結(jié)果。對(duì)于亞細(xì)胞靶標(biāo)的共定位或復(fù)染色，請(qǐng)選擇對(duì)細(xì)胞器標(biāo)記特異的抗體。

6. 決定直接或間接染色：兩種方法都有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇。使用這兩種方法，都應(yīng)該確保充足的洗滌以最小化非特異性的結(jié)合。

7. 選擇沒(méi)有光譜重疊的熒光團(tuán)：IF是一種很好的多路復(fù)用分析技術(shù)，測(cè)量如此多的參數(shù)，那么使用能夠提供可分辨信號(hào)的熒光團(tuán)是很有必要的。